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简介

  
它主要由带针尖的微悬臂、微悬臂运动检测装置、监控其运动的反馈回路、使样品进行扫描的压电陶瓷扫描器件、计算机控制的图像采集、显示及处理系统组成。微悬臂运动可用如隧道电流检测等电学方法或光束偏转法、干涉法等光学方法检测,当针尖与样品充分接近相互之间存在短程相互斥力时,检测该斥力可获得表面原子级分辨图像,一般情况下分辨率也在纳米级水平。AFM测量对样品无特殊要求,可测量固体表面、吸附体系等。

原理

概括

  原子力显微镜:是一种利用原子,分子间的相互作用力来观察物体表面微观形貌的新型实验技术.它有一根纳米级的探针,被固定在可灵敏操控的微米级弹性悬臂上.当探针很靠近样品时,其顶端的原子与样品表面原子间的作用力会使悬臂弯曲,偏离原来的位置.根据扫描样品时探针的偏离量或振动频率重建三维图像.就能间接获得样品表面的形貌或原子成分.

详细

  
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原子力显微镜的基本原理是:将一个对微弱力极敏感的微悬臂一端固定,另一端有一微小的针尖,针尖与样品表面轻轻接触,由于针尖尖端原子与样品表面原子间存在极微弱的排斥力,通过在扫描时控制这种力的恒定,带有针尖的微悬臂将对应于针尖与样品表面原子间作用力的等位面而在垂直于样品的表面方向起伏运动。利用光学检测法或隧道电流检测法,可测得微悬臂对应于扫描各点的位置变化,从而可以获得样品表面形貌的信息。下面,我们以激光检测原子力显微镜(AtomicForce Microscope Employing Laser Beam Deflection for ForceDetection, Laser-AFM)——扫描探针显微镜家族中最常用的一种为例,来详细说明其工作原理。

  如图1所示,二极管激光器(LaserDiode)发出的激光束经过光学系统聚焦在微悬臂(Cantilever)背面,并从微悬臂背面反射到由光电二极管构成的光斑位置检测器(Detector)。在样品扫描时,由于样品表面的原子与微悬臂探针尖端的原子间的相互作用力,微悬臂将随样品表面形貌而弯曲起伏,反射光束也将随之偏移,因而,通过光电二极管检测光斑位置的变化,就能获得被测样品表面形貌的信息。

  
在系统检测成像全过程中,探针和被测样品间的距离始终保持在纳米(10e-9米)量级,距离太大不能获得样品表面的信息,距离太小会损伤探针和被测样品,反馈回路(Feedback)的作用就是在工作过程中,由探针得到探针-样品相互作用的强度,来改变加在样品扫描器垂直方向的电压,从而使样品伸缩,调节探针和被测样品间的距离,反过来控制探针-样品相互作用的强度,实现反馈控制。因此,反馈控制是本系统的核心工作机制。本系统采用数字反馈控制回路,用户在控制软件的参数工具栏通过以参考电流、积分增益和比例增益几个参数的设置来对该反馈回路的特性进行控制。

优缺点

优点

  
相对于扫描电子显微镜,原子力显微镜具有许多优点。不同于电子显微镜只能提供二维图像,AFM提供真正的三维表面图。同时,AFM不需要对样品的任何特殊处理,如镀铜或碳,这种处理对样品会造成不可逆转的伤害。第三,电子显微镜需要运行在高真空条件下,原子力显微镜在常压下甚至在液体环境下都可以良好工作。这样可以用来研究生物宏观分子,甚至活的生物组织。

缺点

  和扫描电子显微镜(SEM)相比,AFM的缺点在于成像范围太小,速度慢,受探头的影响太大。原子力显微镜(Atomic ForceMicroscope)是继扫描隧道显微镜(Scanning TunnelingMicroscope)之后发明的一种具有原子级高分辨的新型仪器,可以在大气和液体环境下对各种材料和样品进行纳米区域的物理性质包括形貌进行探测,或者直接进行纳米操纵;现已广泛应用于半导体纳米功能材料、生物、化工、食品、医药研究和科研院所各种纳米相关学科的研究实验等领域中,成为纳米科学研究的基本工具。原子力显微镜与扫描隧道显微镜相比,由于能观测非导电样品,因此具有更为广泛的适用性。当前在科学研究和工业界广泛使用的扫描力显微镜(ScanningForce Microscope),其基础就是原子力显微镜。

仪器结构

  在原子力显微镜(Atomic ForceMicroscopy,AFM)的系统中,可分成三个部分:力检测部分、位置检测部分、反馈系统。

力检测部分

  在原子力显微镜(AFM)的系统中,所要检测的力是原子与原子之间的范德华力。所以在本系统中是使用微小悬臂(cantilever)来检测原子之间力的变化量。微悬臂通常由一个一般100~500μm长和大约500nm~5μm厚的硅片或氮化硅片制成。微悬臂顶端有一个尖锐针尖,用来检测样品-针尖间的相互作用力。这微小悬臂有一定的规格,例如:长度、宽度、弹性系数以及针尖的形状,而这些规格的选择是依照样品的特性,以及操作模式的不同,而选择不同类型的探针。

位置检测部分

  
在原子力显微镜(AFM)的系统中,当针尖与样品之间有了交互作用之后,会使得悬臂cantilever摆动,所以当激光照射在微悬臂的末端时,其反射光的位置也会因为悬臂摆动而有所改变,这就造成偏移量的产生。在整个系统中是依靠激光光斑位置检测器将偏移量记录下并转换成电的信号,以供SPM控制器作信号处理。

反馈系统

  在原子力显微镜(AFM)的系统中,将信号经由激光检测器取入之后,在反馈系统中会将此信号当作反馈信号,作为内部的调整信号,并驱使通常由压电陶瓷管制作的扫描器做适当的移动,以保持样品与针尖保持一定的作用力。

总结

  AFM系统使用压电陶瓷管制作的扫描器精确控制微小的扫描移动。压电陶瓷是一种性能奇特的材料,当在压电陶瓷对称的两个端面加上电压时,压电陶瓷会按特定的方向伸长或缩短。而伸长或缩短的尺寸与所加的电压的大小成线性关系。也就是说,可以通过改变电压来控制压电陶瓷的微小伸缩。通常把三个分别代表X,Y,Z方向的压电陶瓷块组成三角架的形状,通过控制X,Y方向伸缩达到驱动探针在样品表面扫描的目的;通过控制Z方向压电陶瓷的伸缩达到控制探针与样品之间距离的目的。

  原子力显微镜(AFM)便是结合以上三个部分来将样品的表面特性呈现出来的:在原子力显微镜(AFM)的系统中,使用微小悬臂(cantilever)来感测针尖与样品之间的相互作用,这作用力会使微悬臂摆动,再利用激光将光照射在悬臂的末端,当摆动形成时,会使反射光的位置改变而造成偏移量,此时激光检测器会记录此偏移量,也会把此时的信号给反馈系统,以利于系统做适当的调整,最后再将样品的表面特性以影像的方式给呈现出来。

工作模式

  原子力显微镜的工作模式是以针尖与样品之间的作用力的形式来分类的。主要有以下3种操作模式:接触模式(contact mode),非接触模式( non - contact mode) 和敲击模式( tapping mode) 。

接触模式

  从概念上来理解,接触模式是AFM最直接的成像模式。 正如名字所描述的那样,AFM在整个扫描成像过程之中,探针针尖始终与样品表面保持亲密的接触,而相互作用力是排斥力。扫描时,悬臂施加在针尖上的力有可能破坏试样的表面结构,因此力的大小范围在10 - 10~10 - 6 N。若样品表面柔嫩而不能承受这样的力,便不宜选用接触模式对样品表面进行成像。

非接触模式

  非接触模式探测试样表面时悬臂在距离试样表面上方5~10 nm 的距离处振荡。这时,样品与针尖之间的相互作用由范德华力控制,通常为10 - 12 N,样品不会被破坏,而且针尖也不会被污染,特别适合于研究柔嫩物体的表面。这种操作模式的不利之处在于要在室温大气环境下实现这种模式十分困难。因为样品表面不可避免地会积聚薄薄的一层水,它会在样品与针尖之间搭起一小小的毛细桥,将针尖与表面吸在一起,从而增加尖端对表面的压力。

敲击模式

  敲击模式介于接触模式和非接触模式之间,是一个杂化的概念。 悬臂在试样表面上方以其共振频率振荡,针尖仅仅是周期性地短暂地接触/敲击样品表面。 这就意味着针尖接触样品时所产生的侧向力被明显地减小了。因此当检测柔嫩的样品时,AFM的敲击模式是最好的选择之一。一旦AFM开始对样品进行成像扫描,装置随即将有关数据输入系统,如表面粗糙度、平均高度、峰谷峰顶之间的最大距离等,用于物体表面分析。同时,AFM 还可以完成力的测量工作,测量悬臂的弯曲程度来确定针尖与样品之间的作用力大小。

三种模式的比较

  接触模式(Contact Mode):

  优点:扫描速度快,是唯一能够获得“原子分辨率”图像的AFM垂直方向上有明显变化的质硬样品,有时更适于用ContactMode扫描成像。

  缺点:横向力影响图像质量在空气中,因为样品表面吸附液层的毛细作用使针尖与样品之间的粘这力很大横向力与粘着力的合力导致图像空间分辨率降低,而且针尖挂擦样品会损坏软质样品(如生物样品,聚合体等)。

  非接触模式(Non-Contact Mode):

  优点:没有力作用于样品表面。

  缺点:由于针尖与样品分离,横向分辨率低;为了避免接触吸附层而导致针尖胶粘,其扫描速度低于Tapping Mode和ContactModeAFM。通常仅用于非常怕水的样品,吸附液层必须薄,如果太厚,针尖会陷入液层,引起反馈不稳,刮擦样品。由于上述缺点,on-contactMode的使用受到限制。

  轻敲模式(Tapping Mode):

  优点:很好的消除了横向力的影响。降低了由吸附液层引起的力,图像分辨率高,适于观测软、易碎、或胶粘性样品,不会损伤其表面。

  缺点:比Contact Mode AFM 的扫描速度慢。

其他模式

  除了上面三种常见的三种工作模式外,原子力显微镜还可以进行下面的工作:

  1、横向力显微镜(LFM)

  横向力显微镜(LFM)是在原子力显微镜(AFM)表面形貌成像基础上发展的新技术之一。工作原理与接触模式的原子力显微镜相似。当微悬臂在样品上方扫描时,由于针尖与样品表面的相互作用,导致悬臂摆动,其摆动的方向大致有两个:垂直与水平方向。一般来说,激光位置探测器所探测到的垂直方向的变化,反映的是样品表面的形态,而在水平方向上所探测到的信号的变化,由于物质表面材料特性的不同,其摩擦系数也不同,所以在扫描的过程中,导致微悬臂左右扭曲的程度也不同,检测器根据激光束在四个象限中,(A+C)-(B+D)这个强度差值来检测微悬臂的扭转弯曲程度。而微悬臂的扭转弯曲程度随表面摩擦特性变化而增减(增加摩擦力导致更大的扭转)。激光检测器的四个象限可以实时分别测量并记录形貌和横向力数据。

  2、曲线测量

  SFM除了形貌测量之外,还能测量力对探针-样品间距离的关系曲线Zt(Zs)。它几乎包含了所有关于样品和针尖间相互作用的必要信息。当微悬臂固定端被垂直接近,然后离开样品表面时,微悬臂和样品间产生了相对移动。而在这个过程中微悬臂自由端的探针也在接近、甚至压入样品表面,然后脱离,此时原子力显微镜(AFM)测量并记录了探针所感受的力,从而得到力曲线。Zs是样品的移动,Zt是微悬臂的移动。这两个移动近似于垂直于样品表面。用悬臂弹性系数c乘以Zt,可以得到力F=c·Zt。如果忽略样品和针尖弹性变形,可以通过s=Zt-Zs给出针尖和样品间相互作用距离s。这样能从Zt(Zs)曲线决定出力-距离关系F(s)。这个技术可以用来测量探针尖和样品表面间的排斥力或长程吸引力,揭示定域的化学和机械性质,像粘附力和弹力,甚至吸附分子层的厚度。如果将探针用特定分子或基团修饰,利用力曲线分析技术就能够给出特异结合分子间的力或键的强度,其中也包括特定分子间的胶体力以及疏水力、长程引力等。

  3、纳米加工

  扫描探针纳米加工技术是纳米科技的核心技术之一,其基本的原理是利用SPM的探针-样品纳米可控定位和运动及其相互作用对样品进行纳米加工操纵,常用的纳米加工技术包括:机械刻蚀、电致/场致刻蚀、浸润笔(Dip-PenNano-lithography,DNP)等。

样品的要求

  原子力显微镜研究对象可以是有机固体、聚合物以及生物大分子等,样品的载体选择范围很大,包括云母片、玻璃片、石墨、抛光硅片、二氧化硅和某些生物膜等,其中最常用的是新剥离的云母片,主要原因是其非常平整且容易处理。而抛光硅片最好要用浓硫酸与30%双氧水的7∶3混合液在90 ℃下煮1h 。利用电性能测试时需要导电性能良好的载体,如石墨或镀有金属的基片。

  试样的厚度,包括试样台的厚度,最大为10mm。如果试样过重,有时会影响Scanner的动作,请不要放过重的试样。试样的大小以不大于试样台的大小(直径20mm)为大致的标准。稍微大一点也没问题。但是,最大值约为40 mm。如果未固定好就进行测量可能产生移位。请固定好后再测定。

应用

  随着科学技术的发展,生命科学开始向定量科学方向发展。大部分实验的研究重点已经变成生物大分子,特别是核酸和蛋白质的结构及其相关功能的关系。因为AFM的工作范围很宽,可以在自然状态(空气或者液体)下对生物医学样品直接进行成像,分辨率也很高。因此,AFM已成为研究生物医学样品和生物大分子的重要工具之一。AFM应用主要包括三个方面:生物细胞的表面形态观测;生物大分子的结构及其他性质的观测研究;生物分子之间力谱曲线的观测。

AFM对生物细胞的表面形态观察

  AFM可以用来对细胞进行形态学观察,并进行图像的分析。通过观察细胞表面形态和三维结构,可以获得细胞的表面积、厚度、宽度和体积等的量化参数等。例如,利用AFM可以对感染病毒后的细胞表面形态的改变、造骨细胞在加入底物(钴铬、钛、钛钒等)后细胞形态和细胞弹性的变化、GTP对胰腺外分泌细胞囊泡高度的影响进行研究。利用AFM还可以对自由基损伤的红细胞膜表面精细结构的研究,直接观察到自由基损伤,以及加女贞子保护作用后,对红细胞膜分子形态学的影响。

生物大分子的结构及其他性质的观测研究

  2.1 蛋白质

  对于蛋白质,AFM的出现极大的推动了其研究进展。AFM可以观察一些常见的蛋白质,诸如白蛋白,血红蛋白,胰岛素及分子马达和噬菌调理素吸附在图同固体界面上的行为,对于了解生物相溶性,体外细胞的生长,蛋白质的纯化,膜中毒有很大帮助。例如,Dufrene等利用AFM考察了吸附在高分子支撑材料表面上的胶原蛋白的组装行为。结合X-射线光电子能谱技术和辐射标记技术,他们提出了一个定性解释其层状结构的几何模型。AFM实验证实了胶原蛋白组装有时连续,有时不连续的性质,通过形貌图也提供了胶原蛋白纤维状结构特征。Quist等利用AFM研究了白蛋白和猪胰岛素在云母基底上的吸附行为,根据AFM 图上不同尺寸的小丘状物质推测,蛋白质有时发生聚集,有时分散分布。Epand等则利用AFM 技术研究了一类感冒病毒的红血球凝集素,首次展示了一种膜溶原蛋白自组装形成病毒折叠蛋白分子外域的实时过程。

  在AFM 观察包裹有紫膜的噬菌调理素蛋白(BR) 的研究中,AFM仪器的改进,检测技术的提高和制样技术的完善得到了集中的体现。在细胞中,分子马达可以将化学能转变为机械运动,防止因为布朗运动导致的细胞中具有方向性的活动出现错误,这些活动包括:肌浆球蛋白,运动蛋白,动力蛋白,螺旋酶,DNA聚合酶和RNA聚合酶等分子马达蛋白的共同特点是沿着一条线性轨道执行一些与生命活动息息相关的功能,比如肌肉的收缩,细胞的分化过程中染色体的隔离,不同细胞间的细胞器的置换以及基因信息的解码和复制等。由于分子马达本身的微型化,它们容易受更高的热能和大的波动的影响,了解马达分子如何正常有序工作就成为一项具有挑战性的任务。利用AFM,人们已经知道了肌动蛋白结合蛋白的结构信息和细胞运动过程中肌动蛋白骨架调控功能。

  2.2 脱氧核糖核酸(DNA)

  AFM液相成像技术的优点在于消除了毛细作用力,针尖粘滞力,更重要的是可以在接近生理条件下考察DNA 的单分子行为。DNA分子在缓冲溶液或水溶液中与基底结合不紧密,是液相AFM面临的主要困难之一。硅烷化试剂,如3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和阳离子磷脂双层修饰的云母基底固定DNA分子,再在缓冲液中利用AFM 成像,可以解决这一难题。在气相条件下阳离子参与DNA的沉积已经发展十分成熟,适于AFM观察。在液相条件下,APTES 修饰的云母基底较常用。目前DNA的许多构象诸如弯曲,超螺旋,小环结构,三链螺旋结构,DNA三通接点构象,DNA 复制和重组的中间体构象,分子开关结构和药物分子插入到DNA链中的相互作用都广泛地被AFM考察,获得了许多新的理解。

  2.3 核糖核酸( RNA)

  AFM对RNA的研究还不是很多。结晶的转运RNA 和单链病毒RNA 以及寡聚Poly (A) 的单链RNA 分子的AFM图像已经被获得。因为在于不同的缓冲条件下,单链RNA 的结构变化十分复杂,所以单链RNA分子的图像不容易采集。(利用AFM成像RNA分子需要对样品进行特殊和复杂的处理。Bayburt 等借鉴Ni2 + 固定DNA的方法在缓冲条件下获得了单链Pre-m RNA 分子的AFM 图像。他们的做法如下: (1) 用酸处理被Ni2 +修饰的云母基底以增加结合力; (2) RNA 分子在70℃退火,慢慢将其冷却至室温再滴加在用酸处理过的Ni2+-云母基底上。采用AFM 单分子力谱技术,在Mg2 + 存在的溶液中,Liphardt 等研究了形貌多变的RNA分子的机械去折叠过程,发现了从发夹结构到三螺旋连接体这些RNA 分子三级结构的过渡态。随后他们又利用RNA分子证实了可逆非平衡功函和可逆平衡自由能在热力学上的等效性。)

  2.4 核酸与蛋白质复合物(Nuclearacids-Protein Complex)

  DNA 和蛋白质分子的特定相互作用在分子生物学中起着关键作用。蛋白质与DNA结合的精确位点图谱和不同细胞状态下结合位点的测定对于了解复杂细胞体系的功能与机理,特别是基因表达的控制都十分关键。AFM作为一种高度分辨达0。1 nm ,宽度分辨率为2 nm左右的表面分析技术,已广泛地用于表征各类DNA-蛋白质的复合物。低湿度大气条件下,Rees 等利用AFM 在接触模式下考察了λ2PL启动子在启动和关闭转录过程中对DNA 链弯曲程度的影响。此外,这个小组还研究了另外一种λ2转录因子,Cro-蛋白对DNA弯曲的影响。为了研究Jun 蛋白的结合是否会引起DNA 链的弯曲,Becker等利用AFM研究了包含一个AP21结合位点的线性化质粒DNA 与Jun 蛋白的复合物。Aizawa小组对DNA 蛋白激酶Ku亚结构域和双链DNA断裂的相关性进行了研究。Kasas 等研究了大肠杆菌RNA 聚合酶(RNAP)转录过程中的动态酶活性。他们的方法是在Zn2 + 存在的条件下,RNAP 能够松散或紧密地与DNA 模板进行结合,通过AFM成像了解其动态过程。

  2.5 细胞( Cell)

  AFM 不仅能够提供超光学极限的细胞结构图像,还能够探测细胞的微机械特性,利用AFM力-曲线技术甚至能够实时地检测细胞动力学和细胞运动过程。利用AFM 研究细胞很少用样品预处理,尤其是能够在近生理条件下对它们进行研究。

  利用AFM直接成像方法,可以对固定的活细胞和亚细胞结构进行了深入研究。这些研究获得了关于细胞器的构造,细胞膜和细胞骨架更详细的信息。将细胞固定在基底上再进行AFM观察,可以得到细胞膜结构的皱褶,层状脂肪物,微端丝和微绒毛等特征。由于细胞质膜掩盖了细胞内部骨架,现在已经发展了一种仔细剥离该层膜的方法,并利用AFM对剥离细胞膜后的结构进行了研究。

  AFM在细胞研究方面的一个最重要用途是对活细胞的动力学过程,细胞间的相互作用以及细胞对其内外干扰因素的响应进行实时成像目前,AFM已经可以对外来病毒感染的细胞进行实时考察。AFM还可以研究活性状态下血小板形状的变化情况和培养的胰腺细胞对淀粉消化酶的响应情况。

  2.6病毒( Virus)

  早期,AFM 在生物学上的应用主要集中在病毒研究。Kolbe 等首次研究了具有不同头尾结构的T4 噬菌体。Imai及其合作者分别对烟草花叶病毒和各类噬菌体进行了考察。烟草花叶病毒( TMV) 或星形烟草花叶病毒(STMV)是迄今研究得最多的病毒类型。在胶体溶液中,TMV非常类似已知的蛋白质行为,可以采用研究蛋白质的方法对其进行考察。利用AFM,可以研究高度过饱和和轻微过饱和条件下TMV的二维成核生长过程。AFM研究表明,当TYMV 暴露在平衡条件下的溶液中,TYMV晶体的(101) 面逐层向上生长,晶格的结构缺陷如空位,单粒子,位错和聚集等现象在AFM 图上区分得十分清楚。Turner等利用从AIDS 病毒中提取的逆转录酶修饰AFM横梁,使之成为一种能检测抑制酶的活力和筛选使AIDS病毒失活药物的方法。自支撑磷脂膜与感冒病毒结合作用以及缺陷位点结构上底物暴露的磷脂单层效应和水合双层磷脂的检测被发展成了一种新型生物传感器,这种传感器能够从其它大分子中识别特定的病毒物质。这些结果都被AFM图像所证实。

原子力显微镜对生物分子之间力谱曲线的观测

  对生物分子表面的各种相互作用力进行测量,是AFM的一个十分重要的功能。这对于了解生物分子的结构和物理特性是非常有意义的。因为这种作用力决定两种分子的相互吸引或者排斥,接近或者离开,化学键的形成或者断裂,生物分子立体构像的维持或者改变等等。在分子间作用力的支配下,还同时支配着生物体内的各种生理现象、生化现象、药物药理现象,以及离子通道的开放或关闭,受体与配体的结合或去结合,酶功能的激活或抑制等等。因此,生物分子间作用力的研究,在某种意义上说,就是对生命体功能活动中最根本原理的研究。这也为人们理解生命原理,提供了一个新的研究手段和工具。

  将两种分子分别固定于AFM的基底和探针尖端上。然后使带有一种分子的探针尖端在垂直方向上不断地接近和离开基底上的另一种分子。这时,两种分子间的相互作用力,就是二者间的相对距离的函数。这种力与距离间的函数关系曲线,称之为力谱曲线。

  利用AFM获得的力谱曲线在生物医学中的应用:在探测一个细胞之后,根据所遇到的阻力,AFM就会赋予一个表明细胞柔软度的数值。研究人员发现,尽管正常细胞的硬度各有不同,但癌细胞比正常细胞要柔软得多,所研究的胰腺、肺部和乳腺细胞均是如此。一些肿瘤的细胞可能比另外一些更为坚硬,那就意味着这些肿瘤恶化转移的可能性较小,对病人的威胁也较小。利用AFM还可以研究不同药物对癌细胞的影响。针对细胞用药后,AFM可以观察在药物的作用下细胞的变化情况。这样可以开发出比当前所用的药物毒性更小、但同样能够阻止正常细胞发生癌变的药物,以免因癌症扩散而危及生命。

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