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各类显微镜的光学参数
图1 秀射电镜的结构示意
图2 扫描电镜的结构示意
19世纪中期的显微镜
带自动照相机的光学显微镜
装有场发射枪的扫描电子显微镜,分辨率为20a
超高压透射电子显微镜,加速电压可达2000kv
r.虎克在17世纪中期制做的复式显微镜
20世纪初期的显微镜,数值孔径达1.4

  利用电子束对样品放大成像的显微镜,简称电镜。电镜的放大倍率可达百万,可分辨样品的最小细节为几个埃,而光学显微镜的放大倍率不过几千,其分辨率在理论上不能小于0.2微米,这是因为受光波波长的局限, 即可见光的波长不能小于4000埃。为此,它促使人们去寻找更短波长的照明物质。

  根据波动学说,运动着的电子可以看作是一种电子波。电子运动的速度越高,电子波的波长越短。例如受200千伏高压加速的电子,其波长仅为0.025埃。这表明电子是一种理想的新光源。此外,20世纪20~30年代,证实了轴对称分布的电磁场具有能使电子束偏转、聚焦的作用,从而找到了相当于光学显微镜中的透镜──电子透镜。这就是具有高分辨率的电子显微镜产生的基础。

  电子显微镜分为透射电镜和扫描电镜两大类 (见彩图)。从性能方面看,光学显微镜不仅分辨率低,而且景深也很短。透射电镜具有极高的分辨率,但由于必须采用超薄样品(如厚度为几百甚至几十埃),所以景深的问题不突出。扫描电镜则在这个意义上填补了两者的空隙,即既有高分辨率,又有大景深(见表)。注:此处所用电镜荧光屏尺寸为100平方毫米,观察者距荧光屏的位置为25厘米,人眼分辨率为0.2毫米。

目录

透射电镜

结构

  透射电镜的工作原理和普通光学显微镜非常相似,包括照明系统、成像系统和观察、照相室等(图1)。

照明系统

  这是样品以上的“光源”部分,包括:①电子枪,电子束的发射源。常用的是发夹形热钨丝三电极式电子枪。灯丝(阴极)由钨丝制成,通电加热后发射电子。发射出的电子束受处于负电位的栅极所调制,并被阳极的高电位(几十~几百千伏)区加速后形成一束“光源”,即电子源。另外还有六硼化镧(LaB6)阴极、点阴极和场发射电子枪等几种高亮度的新型电子枪。②聚光镜,一种电磁透镜,由外包铁壳的线圈形成。当线圈中通有电流时,铁壳的缝隙处集中产生磁场,控制电子束的运动。聚光镜的作用是将电子枪发出的电子流会聚后照射到样品上。透射电镜中通常有两个聚光镜,可以灵活控制照到样品上的光斑大小、强度和照明束的张角。为了校正各部件之间可能出现的不合轴现象,照明系统中都装有对中用的电子枪偏转器和聚光镜偏转器。针对有些研究工作需要利用倾斜的电子束照明,有些电镜中在样品上方还装有电子束偏转器。由于透镜结构的不理想和电子束与镜筒中残余气体分子作用的生成物会造成透镜场的非轴对称性,亦称像散,它将影响成像的质量。聚光镜消像散器就是用来消除电子束斑的这种非轴对称性的。

成像系统

  包括样品及样品以下的电磁透镜。经过特殊制备的薄样品被放在直径为2~3毫米的铜网上,再把铜网放在支架上并插入电镜中。样品架可以平移、倾动和旋转。成像系统由物镜、中间镜和投影镜等电磁透镜组成。样品首先被紧靠在它下部的物镜形成第一级像,然后由中间镜和投影镜相继放大,最后在荧光屏或照相底片上形成一个高放大倍率的显微像。改变各透镜电流可以在很大范围内改变图像的大小(例如从100~1000000倍)。图像的聚焦是靠调节物镜电流来实现的。

  物镜是整个仪器中最重要的部分,它决定着电镜分辨率。为改善电镜的性能,目前的趋势是研究低球差的“聚光-物镜”。 这种物镜所产生的电磁场可以分解成上、下两部分。上半部分起进一步聚光的作用,下半部分才是成像的物镜场。样品插在这两部分透镜场的中心。物镜系统的另一重要组件是物镜消像散器,用于获得优质的高放大像。

观察室和照相室

  为了使人眼能观察到电子形成的样品像,电镜采用荧光屏显示和照相底片记录两种方式。荧光屏显示适用于快速观察和调整仪器;照相底片便于分析、保存或放大。通过放大,人们可以充分利用样品上的各种微细信息。照相室在观察室的下部,其中放有照相底片的发送盒和接收盒各一个。人们通过观察荧光屏确认图像已调好,便可依靠照相传动装置把荧光屏抬起,同时把发送盒中的底片送到预定位置,待曝光后底片将自动进入接收盒内。装有图像增强系统的电镜中,采用的是“透射式”检测器,由其将取得的信号送到显像管处,图像便可显示在显像管的荧光屏上。这种设备可靠电子线路来增强图像的光强并调节衬度,因此适用于低衬度和易产生辐照损伤的样品(如生物组织等)。此外,为了防止电子在行进过程中受到气体分子的干扰,电镜内部保持的真空度要在10-5托(10-8大气压)以上。电源系统的高稳定度也是保证图像质量的重要因素之一。目前一些高性能电镜的样品室真空度可优于10-7托,电源稳定度已达10-6/分钟。

成像原理

  光学显微镜中图像的衬度(即对比度或反差)决定于样品上各部位对光的不同吸收。电镜中图像衬度的形成却主要靠样品对电子波的散射及其相互间的干涉。通常可以把图像衬度分成散射吸收衬度,衍射衬度和相位衬度等。

  固体样品能使入射电子通过时,产生弹性散射和非弹性散射。被散射后的电子分布在一定的角度范围内。其中弹性散射电子的强度正比于样品各部分的质量厚度之积。质量厚度越大,大角度散射的电子数越多。在物镜下方设置一个带孔的圆片(即物镜光阑),就可以用来拦掉部分大角度的散射电子。这样,样品中较致密和较厚的部分被拦掉的电子数较多,对应于图像上的暗区,反之为亮区。这种衬度称散射吸收衬度,可以提供样品形态方面的信息。

  在晶体样品中当其某组原子面满足布拉格衍射条件时,还将在样品以下某些特定的方向处形成一些互相分离的加强电子束,即衍射束。可以用孔径很小的物镜光阑选取一束电子来成像。由于样品各部分满足布拉格条件的程度不同,被光阑阻挡的电子数不同,从而形成明暗不同的图像衬度,即衍射衬度,可提供样品的结晶学信息。经常能观察到的晶体等倾纹和等厚纹等,就属于这一类。

  当极薄、小颗粒或低密度样品成像时,主要应该利用相位衬度。样品受电子波照射后会产生不同的散射波。在条件合适时,这些散射波将按一定的相位关系干涉成像,这就是相位衬度像。它是一种高分辨率的像,可用于研究原子尺度(小于10埃)的样品微结构。

性能和特点

分辨率

  电镜的质量是以图像上所反映出的“分辨率”来表示的,分辨率为样品上可分辨两点之间的最小距离,通常也称为点分辨率。常规电镜的分辨率极限是2~3埃。目前商品电镜的指标已接近此理论值。当样品细节下降到10埃或更小时,样品上某种细节能见与否,不仅决定于原来意义上的分辨率,而且还决定于照明束的特性、透镜象差及样品细节的形状、位置和衬度条件等,这是相位衬度像的特点。对于这种实验条件下的仪器分辨率至今尚未做出明确的定义。但是可分辨晶面条纹的最小间距常被采用为表示仪器质量的另一种标志,称为线(或晶格)分辨率。目前透射电镜可实现的最高线分辨率为1埃左右。

放大倍率

  透射电镜的放大倍率幅度很大,可从几百到几十万甚至几百万倍。低放大倍率有利于寻找样品并观察样品的全貌。而为了充分利用电镜高分辨率的特性获取微细信息就应有足够高的放大倍率。例如仪器的分辨率是4埃,人眼分辨率是0.2毫米(1毫米=107埃),则电镜的最高放大倍率应不低于50万倍。由于照相底片的分辨能优于人眼,所以通常可以在稍低的放大倍率下照相,然后把底片光学放大10倍左右,从中提取极微细的信息。

局限性

  高速电子对样品的穿透能力有限,必须把待观察物制备成超薄(几百埃甚至几十埃)的电镜样品。因此难以从电镜上直接得出样品的三维结构。样品制备过程有时还会带来一些人为的效应,使观察到的图像失真。所以对图像的解释必须慎重。另一方面,生物样品的组成大部分是轻元素,对电子的散射能力很弱。而经过重金属染色等技术增加衬度后,样品组织表现得比较粗糙,难以给出分辨率优于20埃的电镜图像。

几种基本的实验技术

明场成像法

  利用物镜光阑仅使中心区的透射电子通过并参与成像的方法。散射电子强的样品区对应于像上的暗区,其周围是亮背景,故称明场像。它的优点是图像较亮,便于观察、调焦和记录。缺点是图像衬度较低,一定程度上影响了分辨率。

暗场成像法

  用物镜光阑取一束非中心区的散射电子(或衍射电子)成像的方法。由于直接透射束完全被光阑阻挡,样品上散射强的区域对应于像上的亮区,无散射区形成暗背景。这种暗背景上的亮像称为暗场像。这种成像法的优点是图像衬度大,分辨率高。缺点是像的光强很弱,不利于调焦和记录。

选区电子衍射法

  当电子束通过晶体样品时将产生若干衍射束。它们相对于透射束的偏转角很小,受物镜的作用后可在物镜后焦面中会聚成一幅衍射花样图;只要中间镜和投影镜调整得合适,衍射图能被清晰地放大后投射在荧光屏或照相底片上,其放大倍率可达几百至几千。这时在物镜以下第一级像平面处插入一个带孔圆片(选区光阑),便可用来限定产生电子衍射的样品区。这就是选区电子衍射法。用这种方法能把样品微区的形态和结晶学信息结合起来进行研究。由于物镜球差和失焦等影响,常规电镜的最小选区约为几千埃,即一般不宜用于比5000埃更小的区域。70年代以来新开发的多种微区衍射新技术,衍射的最小选区可至几百埃以至几十埃。

晶格成像法

  晶格像一般有两种含意,一是反映晶体样品中晶面的一维或二维条纹像,另一种是能反映晶体结构(直接揭示固体中原子排列情况)的结构像。前者是由透射束和一个或数个衍射束干涉而成的像,这种像表现为周期性的条纹或交叉格子,在一定条件下它们的间距对应于样品中的某组晶面间距。

物体的三维重建

  生物体的功能与分子的三维结构及其排列情况密切相关。一张显微像只是一个二维投影,用几张对应于样品不同角度的二维投影像组合成该样品的一个三维模型的技术称为物体的三维重建。电镜中的这项工作要求有一个很好的同心倾动样品台。对于待分析样品,从不同的倾角拍摄若干张显微像,再借助于电子计算机,用数值计算法处理(指傅利叶变换等)这些像的强度值,就能给出一个重建的三维结构(见三维测体技术)。

电子全息技术

  在电镜中,利用特殊的电子束点光源照射有一定厚度分布的样品,并使直接入射波(也称参考波)和样品的散射波相互干涉形成一种图像,这就是全息像。把这种显影后的全息底片放到一个光学装置中重现,可以观察到一幅逼真的立体图像。电子全息技术的实验方法比较复杂,所以目前尚未得到广泛的应用。

扫描电镜

结构和原理

  扫描电镜利用从块状样品表面收集到的信号电子成像,因此相当于一种“反射式”显微镜(个别情况下也可采用透射模式)。

结构

  它包括三个重要的组成部分(图2)。①能产生作特殊运动的电子束的部件──电子光学系统;②电子束与样品相互作用的场所──样品室;③信号的收集、处理和显示系统。

成像原理

  从电子枪发出的电子束(相当于直径为30~50微米的有效光源)在 1~30千伏加速电压的作用下进入透镜区;经过几个透镜的作用后会聚成直径仅为几十埃的细电子束,通常称为电子探针;在物镜上方的扫描线圈控制电子束在样品表面作光栅状扫描;被加速的高能电子在样品室中与样品相互作用,从而产生各种信号。样品室较大,样品在其中可作各方向的移动和旋转。此外,大样品室还便于安装各种附件,检测各种不同的信号。

  收集不同的信号可以实现不同的实验目的。扫描电镜的功能主要是显示样品表面的形貌,所收集的大部分是非弹性散射电子激发的二次电子及部分背散射电子。二次电子的强度分布与样品表面形态密切相关,有较高的分辨率,这些信号电子被闪烁体检测,经光导管、光电倍增管和放大器等作用后,形成信号电压加到显像管的栅极上。信号电压控制着荧光屏上光点的亮度。显像管中的电子束与镜筒中电子束呈同步扫描,荧光屏上就能出现一幅代表样品表面形貌的二次电子像。这种像是逐点形成的,所以用于观察的显像管应有长余辉荧光屏,而用于记录的显像管则应是短余辉的。

性能和特点

  扫描电镜的优点是:景深长,图像富有立体感;图像放大倍率的连续可变范围大;二次电子像的分辨率可达50埃或更佳;样品制备技术简单,不必作超薄处理,而且电子辐照引起的样品损伤和污染也较小。在扫描电镜上装配各种附件后,还可获得高分辨率的样品表面形貌,提供通道图样(确定晶体取向)、任何部位的元素分析和元素分布图、样品反射及透射模式的荧光图像等功能效用。所用的信号电子主要有二次电子、背散射电子、特征X射线、阴极荧光和俄歇电子。          

发展方向

  70年代以来,电镜的发展主要在:①不断提高分辨率,以求观察更精细的物质结构、微小的实体以至单个原子;②研制超高压电镜和特殊环境的样品室,以研究物体在自然状态下的形貌及动态性质;③研制能对样品进行综合分析(包括形态、结构和化学成分等)的设备。

  参考书目

  朱宜、张存珪:《电子显微镜的原理和使用》,北京大学出版社,1983。

  郭可信等:《电子衍射图在晶体学中的应用》,科学出版社,北京,1983。

  葛肇生译:《扫描电子显微镜》,机械工业出版社,北京,1983。

  M.A.Hayat,Principles and Techniques of Electron Microscopy:Biological Applications, Vol.3, Van Nostrand Reinhold, New York, 1974.

  J.J.Hren et al., Introduction to Analytical Electron Microscopy,Plenum Press,New York, 1979.

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