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概述

  以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体)连接后转化受体菌,则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增,这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达,而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同,所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多,能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说,从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同,基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因,而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

  真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列.采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难.

  高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多.

定 义

  (cDNA Library)

  某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组,并将其引入到相应的宿主细胞中(一般为E.coli.)繁殖和扩增,理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息,称该生物基因组的cDNA文库。

原理

  :将带poly(A)的mRNA经酶促反应转变为双链DNA,再与原核载体连接.

制备用于克隆cDNA的mRNA

  1,mRNA的制备

  动物细胞mRNA的制备

  植物细胞mRNA的制备

  2,mRNA的来源

  选用mRNA含量高的组织材料,或通过药物等方法提高mRNA的含量

  3,mRNA完整性的检测

  1)mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(Cell-free translationsystem),又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为"溶胞粗制品翻译系统".

  无细胞提取物的制备:

  用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心出去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统.

  常见的体外无细胞翻译系统:

  兔网织红细胞系统。网织红细胞无细胞核,其合成的蛋白质90%以上为珠蛋白.

  缺 点:已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去体系中的珠蛋白mRNA .

  麦胚系统

  用组织捣碎机将麦子捣碎,分离出麦胚.然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨.23000g离心所得的上清夜称为S23;将S23分装,保存于-20°C冰箱中.

  利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时,需加的物质与网织红细胞系统相似.由于该体系无mRNA,所以必须加入mRNA.

  优 点:适于研究mRNA,活力强,价格低廉等.

  缺 点:不同制品的活性差别较大,且合成分子量较大(71X105 Dal)的蛋白质时往往提前终止.

  哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译

  *SDS-PAGE analysis of proteins translated by cell-freetranslation system. Lane 1: protein marker; Lane 2,without mRNA;Lane 3 to 7: translation products of total mRNA from mammaliancells

  2) mRNA在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力

  3)mRNA分子的大小

  哺乳动物mRNA长度为500-8000bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间.

  4) 总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力

  利用哺乳动物细胞提取的poly(A)+RNA合成cDNA

  *Lane 1: -HindIII-EcoRI; Lane 2: the first chain of cDNA;

  Lane 3: the second chain of cDNA; Lane 4: -HindIII

  4,mRNA在细胞中的丰度

  1) 高丰度mRNA

  目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%, 该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA .

  2) 低丰度mRNA

  目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下.

  5,mRNA的富集方法

  典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝.

  mRNA的丰度与文库克隆子数的关系

  ln(1-P)

  N= ln(1-1/n)

  N: 所需克隆数; P: 要求的概率; n:一种mRNA在总mRNA中的相对比例

  1) 按大小对mRNA进行分级分离

  * 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子,该方法的分离效果最好,但从凝胶中回收的得率较低.

  * 蔗糖梯度离心:加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等,再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.

  2) cDNA的分级分离

  * mRNA通过反转录形成cDNA,在插入到克隆载体前,通过琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的cDNA分子分离开来.

  * 优 点:

  a)避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解

  b)增加了获得全长cDNA克隆的概率

  c)获得更准确的分级分离效果(分子量)

  3)多聚核糖体免疫学纯化法

  *使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体.将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱(A蛋白-Sepharose柱)上,随后用EDTA将多聚核糖体解离下来,并通过Oligo(dT)层析分离mRNA,利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍. 目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝.

cDNA第一链的合成

  oligo(dT)引导的DNA合成法:

  利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.

  缺 陷:

  因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.

  随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) :

  根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始.

cDNA第二链的合成

  1,自身引导合成法:

  单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.

  缺 点:

  在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排.S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.

  自身引导法合成双链cDNA

  2,置换合成法

  原 理:

  以第一链合成产物cDNA:mRNA杂交体作为切口平移的模板,RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.

  优点:a)合成cDNA的效率高

  b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化

  c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA

  3,引物-衔接头法

双链cDNA分子的克隆

  将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠杆菌寄主细胞增殖.

  1,同聚物加尾法

  利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3'-端都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个片段连接成重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞.

  同聚物加尾法克隆双链cDNA

  2,接头-衔接头法

  3,mRNA-cDNA克隆法

  方 法:

  在mRNA反转录合成cDNA第一链后,将dA残基加到mRNA:cDNA杂交体上,然后与带dT尾的克隆载体连接,转化受体细胞,在宿主细胞内,mRNA被降解并代之以DNA.

  缺 点:

  克隆的效率低(为双链cDNA克隆的1/10)

  4,Okayama-Berg法合成并克隆双链cDNA

cDNA文库的筛选和鉴定

  1,核酸杂交

  是最常用,最可靠的方法之一.可大规模地分析文库的克隆子.

  1)同源探针:至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.

  2)部分同源探针:探针的序列与所要筛选的cDNA克隆的序列相关但不相同.常用于克隆家族基因.

  3)总cDNA探针:

  通过反转录酶均匀掺入放射性核苷酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+mRNA进行末端标记而获得cDNA探针.

  cDNA扣除探针:

  从第一种mRNA制备cDNA探 针, 连续多次与20倍过量的第二种mRNA杂交;

  回收未杂交的cDNA探针, 再与100倍过量的第一种mRNA杂交, 使得原mRNA中的一些特异序列得到高度富集.

  * 主要用于探测cDNA文库中与调节水平有所差别的mRNA克隆.

  5) 合成寡核苷酸探针

  2,特异性免疫学检测

  在cDNA表达文库中,目的基因的表达产 物能与特异性抗体发生免疫学反应,通过酶学的方法加以检测

  3,cDNA克隆的同胞检测

  将cDNA文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的亚cDNA文库,对每组亚cDNA文库进行检测,当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测,直到获得阳性单克隆.

  4,cDNA克隆的确证

  cDNA克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框.

  第四节 目的基因的分离

  外源基因:

  插入到载体内的那个特定的片段基因.

  目的基因:

  那些已被或者准备要分离,改造,扩增或表达的特定基因或DNA片段.

鸟枪法(Shot gun):

  又叫霰弹法,其特点是绕过直接分离基因这一关.由于目的基因在整个基因组中太少太小,在相当程度上靠"运气".

  原 理:

  基因组DNA

  物理(剪切力,超声波等) 或生化方法(限制性内切酶)切割

  长度与一般基因大小相当的DNA片段的混合物

  随机地重组入适当的载体

  转 化

  大肠杆菌中扩增

  适当的方法筛选

  要求有简便的筛选方法:

  利用特定基因缺陷型(如营养缺陷型等)的受体细胞,或特定的寡核苷酸DNA片段探针以特定基因产物的抗体,可通过双表型的筛选或用分子杂交技术,免疫筛选技术检出目的基因.

  示例:面包酵母吲哚甘油磷酸脱氢酶基因的制取

  EcoRI 载体

  酵母DNA 片段基因 重组DNA

  转化

  "吲哚甘油磷酸脱氢酶型组氨酸缺陷型"大肠杆菌

  基本培养基

  筛选,分离菌株

  目的基因

物理化学方法

  基因工程初始阶段所用的方法,目前已不用.利用核酸双螺旋之间存在着碱基G C,A T配对特性,分离目的基因.

  例如:海胆rDNA分子内其GC含量可以达63%(其稳定性高,溶解温度高),通过热变性和S1酶解处理可得到提纯50倍的rDNA,最后经氯化铯平衡梯度离心,得到相对分子量为1.9X107Dal的高纯rDNA.

  从基因文库中分离目的基因

从蛋白质入手分离编码此蛋白的基因

  如果手中有足够量可产生抗体的来源于真核细胞的蛋白质,可以通过双抗体免疫法分离出此蛋白的基因.

  基本原理:

  核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白体,而具有不同长度的新生肽链在核糖体上不断延伸;

  将从细胞匀浆液中制备出的多聚核糖核蛋白体同特定抗体一起保温,形成多聚核糖体同抗体的复合体;

  当加入特定蛋白的抗体产生的第二抗体时,产生沉淀,就可以通过不连续蔗糖梯度离心,将所要的含有特定的mRNA的多聚核糖体同总多聚核糖体分离;再通过酚,氯仿抽提去除蛋白及oligo-dT柱亲合层析,就可以得到为特定蛋白编码的mRNA,再通过反转录得到cDNA.

基因的化学合成

  基因片段的全化学合成

  首先合成一个基因的所有片段,相邻的片段间有4—6个碱基的重叠互补,退火后,用T4DNA连接酶将各片段以磷酸二酯键的共价键形式连接成一个完整的基因.

  基因的化学—酶促合成

  不需要合成完整基因的所有寡核苷酸片段,而是合成其中一些片段,相邻的3'-末端有一短的顺序相互补,在适当的条件下通过退火形成模板—引物复合体,然后在存在四种的条件下,用大肠杆菌DNA聚合酶I大片段填补互补片段之间的缺口,最后用T4DNA连接酶连接及适当的限制性内切酶.

PCR技术在目的基因制备中的应用

  目的基因的直接克隆

  与常规的基因克隆方法相比,PCR的优点是快速,简单,但是用PCR克隆目的基因的限制是必须知道侧接靶序列的核苷酸序列,以制备引物.因而该法具有很大的局限性.

  可直接利用具有平端的PCR产物进行克隆,但利用合适的引物,在待克隆的目的基因二侧引入不同的限制性酶切点,则可将扩增之后的目的基因定向克隆到载体中,避免载体的自身环化,提高克隆效率.

  cDNA的克隆

  利用PCR技术,只需增加一步逆转录反应,便可从少数mRNA的构建cDNA文库,以mRNA为模板,以oligo(dT)为引物,在依赖于RNA的DNA聚合酶催化下体外合成cDNA第一链之后,可通过PCR扩增此链.

  如在此链的3'端再加上一段鸟苷酸残基同聚物,则可以使用oligo(dT)和oligo(dC)作为后续PCR扩增的引物,也可酌情在这些引物的5'端加上限制性酶切点,以利于将所得的双链DNA克隆到适当的载体中.

  在某些情况下,如已知RNA(或其基因)两端的核苷酸序列,mRNA5'端核苷酸序列或其编码的蛋白质N端的氨基酸序列,便可设计特定的两端引物,用于直接克隆特定的目的基因cDNA,从而省略从cDNA文库中筛选cDNA克隆等序列费时的操作.

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