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DNA修复(DNA repairing)

一、DNA的损伤

  
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环境作用

  1.物理因素

  ²紫外线:形成嘧啶二聚体,使转录终止,复制受阻。

  ²电离辐射:αβγX-射线等,主要通过电离作用造成损伤。可造成多种损伤,如DNA断裂、碱基脱落、杂环破裂、氧化等。

  2.化学因素

  ²烷化剂:有活泼烷基,可转移到碱基或磷酸上,如硫酸二甲酯、芥子气等。鸟嘌呤的O6和N7最易烷化,导致错配(GT)或脱落。磷酸三酯不稳定,易断裂。双功能试剂可造成交联。

  ²碱基或核苷类似物:FU、BrdU、6-巯基嘌呤等。可竞争抑制核苷酸合成或掺入核酸导致错配。

  ²亚硝酸盐及亚硝胺:前者造成脱氨,后者氧化后生成烷化剂和自由基

  ²代谢活化化合物:如苯并、黄曲霉毒素等。经混合功能氧化酶催化形成环氧化物,与核酸结合,造成突变。以上物理及化学因素统称诱变剂。

  3.生物因素

  ²DNA、RNA肿瘤病毒可插入基因组,引起突变。

自发性损伤

  1.复制时的碱基错配

  2.互变异构:A=NH时可形成A=C,G-OH时可形成GT三键配对

  3.碱基脱氨:C-U,A-I,G-X

  4.碱基丢失:大肠杆菌每代丢失一个嘌呤,哺乳动物可达一万个。嘧啶丢失几率只有嘌呤的1/20。

DNA修复

光修复

  这是最早发现的DNA修复方式。修复是由细菌中的DNA光解酶(photolyase)完成,此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体,并与其结合,这步反应不需要光;结合后如受300-600nm波长的光照射,则此酶就被激活,将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体,然后酶从DNA链上释放,DNA恢复正常结构。后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中,人体细胞中也有发现。DNA光解酶可被可见光(300-600纳米,400纳米最有效)激活,分解由于紫外线照射而形成的嘧啶二聚体。此酶广泛存在,但人体只存在于淋巴细胞和皮肤成纤维细胞,且是次要修复方式。

切除修复

  (一)细胞内有多种特异的核酸内切酶,可识别DNA的损伤部位,在其附近将DNA单链切开,再由外切酶将损伤链切除,由聚合酶以完整链为模板进行修复合成,最后有连接酶封口。

  (二)碱基脱氨形成的尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤可被专一的N-糖苷酶切除,然后用AP(apurinic/apyrimidinic,缺嘌呤或缺嘧啶)核酸内切酶打开磷酸二酯键,进行切除修复。DNA合成时消耗NADPH合成胸腺嘧啶,可与胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶相区别,提高复制的忠实性。RNA是不修复的,所以采用“廉价”的尿嘧啶。

  (三)切除修复不需光照,也称暗修复。大肠杆菌中有UvrABC系统,可切除修复嘧啶二聚体。人体缺乏相应系统则发生“着色性干皮病”,皮肤干燥,有色素沉着,易患皮肤癌。可加入T4内切酶治疗。

单链断裂的重接

  DNA单链断裂是常见的损伤,其中一部分可仅由DNA连接酶(ligase)参与而完全修复。此酶在各类生物各种细胞中都普遍存在,修复反应容易进行。但双链断裂缺几乎不能修复。

碱基的直接插入

  DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点,能被DNA嘌呤插入酶(insertase)识别结合,在K+存在的条件下,催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键,且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对,使DNA完全恢复。

烷基的转移

  在细胞中发现有一种O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶,能直接将甲基从DNA链鸟嘌呤O6位上的甲基移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA。这个酶的修复能力并不很强,但在低剂量烷化剂作用下能诱导出此酶的修复活性。

重组修复

  此过程也叫复制后修复。重组修复中原损伤没有除去,但若干代后可逐渐稀释,消除其影响。所需要的酶包括与重组及修复合成有关的酶,如重组蛋白A、B、C及DNA聚合酶、连接酶等。

诱导修复

  DNA严重损伤能引起一系列复杂的诱导效应,称为应急反应,包括修复效应、诱变效应、分裂抑制及溶原菌释放噬菌体等。细胞癌变也可能与应急反应有关。应急反应诱导切除和重组修复酶系,还诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶,加快修复,避免死亡,但提高了变异率。单链DNA诱导重组蛋白A,可水解LexA蛋白,使一系列基因得到表达,如RecA、UvrABC、SOS修复所需的酶等,产生应急反应。应急反应可作为致癌物的简易检测方法。采用缺乏修复系统、膜透性高的E.coli突变株,并添加鼠肝匀浆液。

Ada蛋白

  也叫适应性蛋白,可识别甲基化的DNA,将甲基转移到自身的半胱氨酸上,不可逆,故称“自杀修复”。可修复磷酸及鸟苷上的甲基。

真核细胞修复特点

  1. 多聚腺苷酸-核糖化:由多聚(ADP-核糖)聚合酶催化,用NAD合成并转移到相应蛋白上。可增加一些修复酶的活性,如连接酶。

  2.转录-修复偶联:转录时,若模板链损伤,则转录暂停,转录因子TFIIS使聚合酶退回,CSA/CSB及TFIIE召集修复。若DNA双链损伤,则模板链优先修复。

E.coli中存在4种基本的DNA修复系统

  直接修复(direct repair),核苷酸切除修复(excision repair)、碱基切除修复(base excisionrepair)和错配修复(mismatch repair)。

直接修复(direct repair)

  是通过一种可连续扫描DNA,识别出损伤部位的蛋白质,将损伤部位直接修复的方法。该修复方法不用切断DNA或切除碱基。

  一些蛋白质可以识别和修复某种损伤的核苷酸和错配的碱基,这些蛋白可以连续监测DNA。胸腺嘧啶二聚体就可以通过直接修复机制修复。胸腺嘧啶二聚体是紫外线辐射造成的。在所有原核生物和真核生物中都存在一种光激活酶(photoreactivatingenzyme),在可见光存在下,这种酶可以结合胸腺嘧啶二聚体引起的扭曲双螺旋部位,催化两个胸腺嘧啶碱基再生,正常的A-T碱基对重新形成,然后光复活酶从已修复好的DNA上脱落。

核苷酸切除修复(excision repair)

  通过切除-修复内切酶使DNA损伤消除的修复方法。一般是切除损伤区,然后在DNA聚合酶的作用下,以露出的单链为模板合成新的互补链,最后用连接酶将缺口连接起来。

  形成胸腺嘧啶二聚体会引起DNA双螺旋结构的变形,这样的损伤也可以通过核苷酸切除系统修复。修复系统中的主要酶ABC切除核酸酶。给出了ABC切除核酸酶修复DNA损伤的过程。首先ABC切除核酸酶从损伤部位的两侧切去含有损伤的DNA链。然后,解旋酶除去内切酶切点之间的DNA片段,有时DNA片段由外切酶降解,产生单链缺口。然后在DNA聚合酶的催化下按照互补链填充缺口,切口最后通过DNA连接酶连接。

碱基切除修复DNA

  糖基化酶(DNAglycosylases)能识别DNA中的不正确碱基,如尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤,这些碱基是由胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤脱氨形成的。DNA糖基化酶可以切断这种碱基N-糖苷键,将其除去,形成的脱嘌呤或脱嘧啶部位通常称为"abasic"部位或AP位点。然后由AP内切核酸酶(APendonucleases)切去含有AP位点的脱氧核糖-5-磷酸,在DNA聚合酶作用下重新放置一个正确的核苷酸,最后通过DNA连接酶将切口封闭。每种DNA糖基化酶通常对一种类型的碱基损伤特异。

错配修复(mismatch repair)

  在含有错配碱基的DNA分子中,使正常核苷酸序列恢复的修复方式。这种修复方式的过程是:识别出下正确地链,切除掉不正确链的部分,然后通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用,合成正确配对的双链DNA。

  错误的DNA复制会导致新合成的链与模板链之间的产生错误的碱基配对。这样的错误可以通过E.coli中的3个蛋白质(MutS、MutH和MutL)校正。该修复系统只校正新合成的DNA,因为新合成DNA链的GATC序列中的A(腺苷酸残基)开始未被甲基化。GATC中A甲基化与否常用来区别新合成的链(未甲基化)和模板链(甲基化)。这一区别很重要,因为修复酶需要识别两个核苷酸残基中的哪一个是错配的,否则如果将正确的核苷酸除去就会导致突变。(右图)说明了MutS、MutH和MutL三种蛋白质是如何校正新合成DNA中的一个错配错误的。未甲基化的GATC序列不需要紧靠着错配碱基,因为错配碱基与GATC序列之间的间隔的DNA序列可以被外切核酸酶切除,是从3ˊ还是从5ˊ方向切除取决于不正确碱基的相对位置。

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