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原理介绍

  自从1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来,至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一.Feulgen染色是经典显示去氧核糖核酸的方法,该法要求用Carnay氏液固定的新鲜组织效果最好,酒精-甲醛液次之,单纯甲醛固定欠佳,效果不满意.

  自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来,其作用机制也久经研究和讨论,现已取得一致意见。其具体反应原理是,标本经稀盐酸水解后,DNA分子中的嘌呤碱基被解离,从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应,形成含有醌基的化合物分子,因醌基为发色团,故可呈现出紫红色。也就是说,DNA经稀酸水解后产生的醛基,具有还原作用,可与无色品红结合形成紫红色化合物,从而显示出DNA的分布。

  2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3

  DNA是主要的遗传物质,集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验,鉴定了染色体上DNA的存在,故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关,此试剂的基本成分是碱性品红,偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸.碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。

  碱性品红原为桃红色,当与亚硫酸作用时被氧化,使醌型变为苯型,由桃红色变为无色透明的N-亚磺酸亚硫酸副品红碱,当它与醛基作用时,其分子式又恢复为醌型结构,呈现紫红色

  利用1N HCl、60℃下水解时,可将DNA分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打断,使嘌呤脱下,并使去氧核糖C-1位置释放醛基与席夫试剂反应显紫红色。细胞中只有DNA才具有这种专一的孚尔根反应,因此利用孚尔根反应,可以鉴定DNA的存在。并广泛应用于核及染色体的研究中。

Feulgen方法应注意的问题

1. 对照切片的制做

  进行Feulgen反应时,一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内,且应为负反应。但需要注意的是,对照切片在schiff试剂中最多不要超过1h (0.5 h即可),时间过长,试剂本身的酸性也会使DNA水解,从而出现假的正反应。

2. 固定剂的选择

  以前很多人认为,选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明,一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。

  但在上述固定剂中,以OsO4和Carnoy效果较好,OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂,只是因OsO4价钱较贵,故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反应中,不能单独使用Bouin定液,因为它是Feulgen反应的最坏固定剂,但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。

3. 水解时间

  Feulgen反应通常用稀酸进行水解,但水解的时间一定要适当。如水解时间不够,反应就会变弱;如水解时间过长。或水解地过于剧烈,则脱氧核糖也易掉下来,反应也会减弱。适当的水解时间一般为8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。

4. Schiff试剂的作用

  Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素,就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红,它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外,Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。

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