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发现过程

  1961年在英国发现了首例MRSA,之后以惊人的速度在世界范围内蔓延,据估计每年大约有十万人因为感染MRSA而住院治疗。MRSA毒性并不比普通的金黄色葡萄球菌更强,只不过由于它抗甲氧西林,使得治疗更为困难而已。最近流行的这种MRSA变体是于1997年在纽约首先发现的,它由于有一种被称为PVL的基因编码毒性较强的毒素,后果会更严重。MRSA以前主要感染住院病人,几乎都是通过身体接触传播的,通常感染那些年纪较大、病情较严重、皮肤有伤口(例如褥疮)或有管子通到体内(如导尿管)的人,健康人很少会被感染。但是这种变体似乎能够感染健康人,在医院之外也开始传播,在拥挤的监狱中颇为流行。最近几个月在美国各地的城镇社区(包括洛杉矶、旧金山、纽约、波士顿、迈阿密等大城市)也出现了多次小规模爆发。多数感染者是男同性恋者,但它可能并非性传染病,而是在皮肤接触中传染的。此外,那些从事身体接触的体育项目的运动员、小学生、新生儿也是高危人群。据洛杉矶郡卫生部发布的消息说,在郡监狱中有近千名犯人被感染,其中有66人需要住院治疗。在洛杉矶市发现数十名男同性恋者被感染,另有35名小学生入院治疗。该病菌可能已跨过大西洋,在欧洲已检测到类似的病菌。

  这种抗药性病菌绝对不是可以抵抗所有的抗生素和药物。事实上,几种常见的抗生素都可以杀死它,通常用万古霉素治疗。对只是皮肤感染的患者,大多数甚至用不着使用抗生素,简单地排脓、包扎伤口就足以对付。如果使用抗生素治疗,则应该坚持服完整个疗程的药。只是携带了病菌而未引起感染的人通常无需治疗。为避免病菌的传播,美国疾病控制中心建议对MRSA病人在单独的病房中隔离治疗,探视病人后要洗手,如果有可能接触到病人的体液,则要戴上一次性手套。为防止被感染上MRSA,平时应做好个人卫生:用皂洗手保持手的清洁;清理、包扎创伤直到愈合;避免接触他人的伤口或伤口流出物。

危害

  从长远来看,超级病菌将会在全世界流行,并对越来越多的抗生素产生抗药性,这才是更让人担心的。抗药性病菌的产生是使用抗菌药物无法避免的结果。每一种抗菌药物进入临床使用后,伴随而来的是出现抗药性病菌。有人可能会问:是因为抗菌药物的刺激使得细菌产生突变,从而具有了抗药性呢,还是细菌本来就存在着少数具有抗药能力的突变株,抗菌药物对细菌作了筛选,使得有抗药能力的突变株占了优势?

  也就是说,抗药性的产生,是因为用进废退,还是因为自然选择?早在上个世纪四十年代,微生物学家已经用一系列巧妙的实验证明了细菌在接触抗菌药物之前,就已存在具有抗药能力的突变株,在这个问题上,自然选择学说是正确的。我们实际上是用抗菌药物对细菌进行了一次自然选择,在绝大多数普通细菌被杀死后,原先并不占优势的、具有抗药性的“超级细菌”存留下来开始大量繁衍。

抗药性机理

  分子生物学产生以后,对细菌抗药性的机理有了透彻的了解。至今我们已发现细菌可通过五种方式抵抗药物作用:产生酶(具有催化能力的蛋白质),使药物结构发生改变或失去活性;改变与药物结合的部分,使之不与药物结合;改变细菌细胞壁的通透性,使药物不能进入细菌;把药物排出细菌;形成一层特殊的膜把细菌包围、保护起来。例如,甲氧西林之所以能够杀死病菌,是由于它能够和细菌中一种被称为青霉素结合蛋白的酶结合,使这种酶失去活性。这种酶参与细菌细胞壁的合成,一旦失去活性,细菌无法形成细胞壁,就被杀死了。但是MRSA可产生一种特殊的青霉素结合蛋白变体,它不容易与甲氧西林结合,在细菌中的其他青霉素结合蛋白都因为与甲氧西林结合而失活后,这种蛋白变体可替代它们完成细胞壁合成的功能,从而产生抗药性。万古霉素一种糖肽类抗菌药物,它和细菌中的另一种分子(细胞壁肽聚糖前体五肽)结合而抑制细菌细胞壁蛋白合成,因此使用万古霉素仍然可以杀死MRSA。但是滥用万古霉素则会产生别的抗药病菌,最常见的是耐万古霉素肠球菌。

  开发新的抗菌药物可以防治已有的抗药病菌,但是迟早又会产生新的抗药病菌。细菌的抗药性是不可避免的,然而并不是不可以控制的。导致超级病菌流行的重要原因是滥用抗菌药物。现在不仅医院、农场、养殖场不必要地大量使用抗菌药物,甚至日常生活中,也频繁使用抗菌药物,无意之中时时刻刻随时随地在对细菌进行筛选,使耐药细菌有更良好的生存环境,从而导致超级病菌越来越流行。因此要减少细菌抗药性,最重要的措施是合理选择、使用抗菌药物。

著名案例

  于2009年6月26日在美国洛杉矶去世的流行音乐之王迈克尔杰克逊,在某次整形手术中不幸感染这种病菌,导致身体以及四肢红肿,皮肤溃烂。也是其服用抗生类药物的主要原因。

  MRSA的特性1. 不均一耐药性[2] MRSA菌落内细菌存在敏感和耐药两个亚群,即一株MRSA中只有一小部分细菌约10-4~10-7,对甲氧西林高度耐药,在50μg/ml甲氧西林条件下尚能生存,而菌落中大多数细菌对甲氧西林敏感,在使用抗生素后的几小时内大量敏感菌被杀死,但少数耐药菌株却缓慢生长,在数小时反又迅速增殖。2. 广谱耐药性 MRSA除对甲氧西林耐药外,对其它所有与甲氧西林相同结构的β-内酰胺类和头孢类抗生素均耐药,MRSA还可通过改变抗生素作用靶位,产生修饰酶,降低膜通透性产生大量PABA等不同机制[3],对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药,唯对万古霉素敏感。3. 生长特殊性 MRSA生长缓慢,在30°C,培养基pH 7.0及高渗(40 g/LNaCl溶液)条件下生长较快[4]。在30°C时,不均一耐药株表现为均一耐药和高度耐药,在37°C又恢复不均一耐药。均一耐药株在>37°C或pH<5.2时,均一耐药性可被抑制而表现为敏感。增加NaCl浓度,低温孵育和延长时间,可使不均一耐药株群体中敏感亚群中的耐药性得到充分表达,即能耐受较高浓度的甲氧西林,而对其中耐药亚群无影响[5]。但最近也有报道,高渗下延长培养时间,会影响MRSA的检出结果,因为在高盐情况下,培养48h,对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(methicillin sensitive Staphylococcusaureus;MSSA)易产生大量β-内酰胺酶,可缓慢水解甲氧西林,导致细菌生长,而误认为MSSA。所以一般MRSA在高盐环境孵育24h,而耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)由于耐药亚群菌数少于金葡菌,应孵育48小时观察结果。 MRSA的耐药机理1. 固有耐药 是由染色体介导的耐药,其耐药性的产生与细菌产生一种青霉素结合蛋白(PBP)有关。产生五种PBP(1,2,3,3′和4),它们具有合成细菌细胞壁的功能。它们与β-内酰胺类抗生素有很高的亲和力,能共价结合于β-内酰胺类药物的活动位点上,失去其活性导致细菌死亡,而MRSA产生了一种独特的PBP,这种分子量增加了78~1000道尔顿的PBP,因其电泳率介于PBP2与PBP3之间,故称为PBP2a或PBP2′[6]。PBP2a对β-内酰胺类抗生素亲和力很低,因而很少或不被β-内酰胺类药结合。在β-内酰胺类抗生素存在的情况下,细菌仍能生长,表现出耐药性。PBP2a的产生是受染色体甲氧西林耐药基因(mecA)来调节的。MRSA与MSSA根本区别在于它们的PBP不同。2. 获得性耐药是质粒介导的耐药。某些菌株通过耐药因子产生大量β-内酰胺酶,使耐酶青霉素缓慢失活,表现出耐药性[7],多为临界耐药。MRSA的分型MRSA分型对追踪传染源,研究型别与感染种类,耐药性的关系有重要作用。国外开展较早的噬菌体分型,将待测菌于肉汤中,35°C孵育6h,涂于分型琼脂平板上,待干后将23种噬菌体注入琼脂平板中的小方格内,再置35°C孵育6h后移至室温过夜观察结果。用4组23种噬菌体,将MRSA分为4群,一般以Ⅰ群为最多[8],也有报告以Ⅲ群为多。噬菌体分型结果常不满意,日本小粟 子证实有29.3%菌株不能分型,且重复性差,不宜用于流行病学调查。质粒图谱分型较为可靠,可分为18个型,能准确地分析菌株之间的相关性,将流行菌株与非流行菌株加以区别。国内MRSA广泛存在分子量为1.6Md、1.8 Md及2.67Md的质粒,不同地区和不同医院会有特殊质粒带。免疫印迹分型法将MRSA分为9个型,以B、C型为最常见,各型含有特征性的分子带,该法比较稳定。染色体限制性内切酶分析可识别病原体DNA链上特异位点及核苷酸序列,能从基因水平显示病原体特征,MRSA还可用血清学、凝固酶、耐药谱等方法分型。现在Southern印迹法也逐渐运用于MRSA的分型。MRSA的检测由于MRSA的不均一耐药性,给其检测带来一定的困难。MRSA的检出率受孵育温度、时间、培养基的pH和NaCl的浓度、菌液的数量等多种因素的影响。因此,目前还没有一种最佳的检测方法。1. 纸片扩散法(K-B法) 平皿中MH琼脂厚度为4 mm,菌液调至0.5麦氏浊度,涂沫于上述平板,甲氧西林含量5μg/片,35°C孵育24 h,抑菌圈≤11 mm为耐药,≥17mm为敏感,由于MRSA通常对其它耐酶半合成青霉素也耐药,因此美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐用苯唑西林来代替检测MRSA。苯唑西林在贮存过程中药效不易降低,且对不均一耐药性检测效果更好,所以国内多数实验室都采用苯唑西林,苯唑西林含量为1μg/片,抑菌圈≤10 mm为耐药,≥13 mm为敏感,11~12 mm为中介。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213(耐药菌株),金黄色葡萄球菌ATCC25923(敏感菌株)。纸片扩散法最大优点是快速、简便、价格便宜,易被检验人员接受。在合适的抗生素及培养温度、菌液的浓度、培养基厚度等条件下,检测MRSA是可行的。但Leneastre等[9]对K-B法和特异性mecA基因DNA片段法鉴定MRSA的结果进行了比较,发现在49株用K-B法鉴定为MSSA的菌株,特异性mecA基因DNA片段法鉴定却有11株含mec A基因;59株用纸片法鉴定为典型MRSA的菌株,有10株却没有特异性mecA基因,这两种方法大约有18%~20%的差异。Chipman[10]等研究也表明以mecA基因检测法为参考方法时,纸片扩散法的符合率为88.2%。这可能与纸片法中的琼脂中没有NaCl成份,一些菌株的耐药性得不到完全表达有关。因此,为提高纸片扩散法检测MRSA的可靠性,最好在MH琼脂中加入40g/L NaCl。 2.肉汤稀释(MIC)法 美国疾病控制中心(CDC)推荐用MH肉汤培养基加NaCl至20g/L浓度,同时加入Ca,Mg离子,将苯唑西林进行倍比稀释,从0.125~16 μg/ml,菌浓度为104/ml,35°C孵育24h,MIC<2 μg/ml为敏感,>4 μg/ml为耐药,该法检出率可达95%,但操作较繁琐。 3. 琼脂稀释(MIC)法 用含20g/L NaCl的MH琼脂将苯唑西林倍比稀释为12个不同浓度并浇注平皿。苯唑西林量终浓度为0.125~256μg/ml。再将菌液(0.5麦氏浊度)点种于含药平皿,35°C孵育24h。该法适用于大量菌株的MRSA检测,结果容易判断,重复性好,但耗时,费力。4 琼脂筛选法 这是1997年NCCLS推荐的MRSA的确证试验,即MH培养基加NaCl(40 g/L)加苯唑西林(6μg/ml),将菌液(0.5麦氏浊度)点种或画线35°C孵育24h,只要平皿有菌生长,即使一个菌落也是MRSA,该法敏感度为100%,常用作校正其它方法的标准,尤其适用于检测抑菌圈直径处于中介度的金黄色葡萄球菌。5. 浓度梯度(Etest)法 是1988年AB Biodisk公司推出,在含20 g/LNaCl的MH琼脂平板上,贴上苯唑西林的试条,菌液调至0.5~1麦氏浊度,35°C孵育24 h,直接读取MIC值。MIC<2μg/ml为敏感,>4μg/ml为耐药。Etest法结合了纸片扩散法和肉汤稀释法的优点,长塑料条含有连续的呈指数梯度变化的苯唑西林(0.016~256μg/ml),故在检测低水平或中等程度耐药的MRSA时结果更为准确。Novak[11]等报道,用Alamar法和Etest法对127株MRSA的检测比较,两者结果相关较高,用Etest法检测127株MRSA,其中93株MIC>256μg/ml,28株在6~256 μg/ml,检出率达96%,Etest法具有精确、可靠、稳定性好的特点,但缺点是价格昂贵。6 自动化药敏检测 目前有Vitek系统、ATB系统、MicroScan系统、SensiterARIS等。将菌液稀释后注入药敏板或孔内,然后通过检测菌液浊度,荧光指示剂的荧光强度或荧光底物的水解反应来判读结果。其优点是快速,但有时对生长缓慢或延迟表达耐药性的MRSA,在3~4h内难以达到检测水平,容易漏检或误报MRSA。7 DNA探针杂交 上述的方法都是检测MRSA耐药表型的方法。MRSA根据其耐药频率可分为1、2、3、4类,其耐药频率为10-7、10-4、10-3以及10-1[12]。上述常规的检测方法对于3、4类MRSA一般不存在问题,但对于低频率的1、2类则很容易造成漏检。因此,对于低水平耐药或临界水平耐药的MRSA,应选择特异性高的分子生物学方法来检测。DNA探针杂交是用特异性的mecA DNA片段经地高辛标记,与可疑菌株进行杂交,有学者报告[13],DNA探针仅与MRSA DNA杂交,与MSSADNA无杂交带,其特异性高于琼脂稀释法,敏感性高于肉汤稀释法,而且可直接用于临床标本,无需先进行细菌分离培养,但探针较贵,保存期较短。8 PCR技术 本世纪80年代末期,国外就有人用聚合酶链反应(PCR)来检测PBP2a的mec A基因。它是根据金黄色葡萄球菌TK784的mecA基因DNA序列[14]设计一引物,再裂解提取被测菌的DNA,在一定条件下进行扩增,经琼脂糖电泳后在紫外灯下观察有无与阳性对照菌株(金黄色葡萄球菌ATCC29213)相同的区带。PCR具有较高的灵敏度,只要被测菌有微量的的基因,即出现阳性结果,因此常作为检测MRSA的参考方法。陈秀枢实验表明[14],金黄色葡萄球菌耐苯唑西林的耐药水平与mecA基因有较好的相关性。MIC>4 μg/ml的22株菌均检出mecA基因。由于PCR很灵敏,有时会因实验室的污染而出现假阳性,为使PCR具有更高的可靠性,必须对其扩增产物进行探针杂交或测序以提高特异性[15]。而有一些耐药基因是沉默基因,不表达mecA基因产物,有时会得出假耐药结论,所以分子生物学方法并非100%的敏感和特异,加上该法前期处理操作繁琐,且需要一定的设备,仅在可疑或特殊情况下做此试验。

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